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定量蛋白质组学主流技术介绍(二)

2017-04-11 18:17作者:admin
【本文导读】本篇介绍定量蛋白质组学除iTRAQ,label free以外的其他技术,其中包括silac,mrm,swath等方法。根据客户实验要求,公司科研人员可以量身定制,提供个性化的蛋白质组学技术服务。

    上篇我们介绍了Label free和iTRAQ这两种蛋白相对定量技术,下面我们将继续介绍定量蛋白质组学的其他技术路线。
    1. SILAC
       细胞培养稳定同位素标记技术(sILAC   isotope Labeling with Amino acids in Cell culture )是在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。两组细胞同时培养,A组添加的是正常的“轻型”氨基酸,B组含有稳定同位素标记的“重型”氨基酸,细胞传达若干代后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白质中,取代了原有的氨基酸。将两组细胞混合后提取蛋白,通过质谱鉴定可出现两段峰值,低分子量的肽段含轻型氨基酸,来源于A组,高分子量的肽段含重型氨基酸,来源于B组。如果SILAC肽段对呈现1:1的比例,则两组样品中此蛋白的丰度无异,反之则有差异。
      sILAC属于体内标记技术,从源头引入质量差异,最大程度的降低了实验系统误差,更接近样品真实状态,不仅适合于进行全细胞蛋白分析,还适合于膜蛋白的鉴定和定量,每个样本只需要几十微克的蛋白量。SILAC定量适用于活体培养细胞的分析,对多个样品或同一样品不同条件下全细胞蛋白或亚细胞蛋白进行差异比较。
     2. MRM
     质谱多反应监测技术(mRM)是一种基于已知或假定的反应离子信息,有针对性地选择数据进行质谱信号采集,对符合规则的离子进行信号记录,去除不符合规则离子信号的干扰,通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。该方法首先检测到具有特异性的母离子,然后只将选定的特异子离子进行质谱信号的采集。最终,通过合成同位素形成的目标肽段,将已知浓度的内标肽与待测样品混合,选择特定母子离子对获得不同的色谱检出信号,比较两者的信号强度值,实现目的蛋白质的绝对定量。
         mrm
     3. SWATH 
        sWATH是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术,是MS/MSALL技术的一种扩展。与传统的shot-gun技术相比,SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息,是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。
应用SWATH采集模式,一次实验即可获得完整的定量与定性结果,无需进行方法优化。它可以采集样品中所有化合物的信息,可以对所有化合物进行追溯、查询和分析。定量方法采用高分辨模式,可以消除干扰,提高选择性,且定量能力可与三重四级杆质谱相媲美,灵敏度和动态范围与SRM分析水平相当。
       sWATH 定量方法基于提取 Transition 峰面积计算出肽段含量,通过肽段含量推理出蛋白质含量的方法。SWATH 定量应用到 proteome-wide 水平就产生了 SWATH 定量蛋白组,以此方法为基础可以迅速锁定几个样品间的差异蛋白质(类似于 iTRAQ 定量蛋白质组)。针对亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本,SWATH定量的效果非常好。
      

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