后修饰组学

技术概述
       蛋白质的N-糖基化位点修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,主要在复杂的多细胞或组织
形成过程中起关键作用。蛋白质的N-糖基化修饰位点具有保守的氨基酸序列NX(S/T),
其中X为除脯氨酸以外的其它氨基酸。

技术原理
        凝素亲和法是目前糖蛋白质组学中应用最广泛的分离富集方法。凝集素(lectin)是一类糖
结合蛋白质,能专一识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖基序列而与之结合,它们与糖链
可逆非共价结合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕获之后,通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将
糖蛋白或糖肽洗脱下来。

       蛋白质经过酶解后利用凝集素(lectin)富集N-糖基化肽段,然后用N-糖酰胺酶(PNGase)
在H218O中切除连接在天冬酰胺残基(Asn)上的糖链。该处理致使Asn分子量增加2.9890Da。
最后用高精度LC-MS质谱仪检测脱糖后的肽段,并通过MASCOT软件检索数据库,确认脱糖后
分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列,从而确定该蛋白质的N-糖基化位点。

       N-糖基化位点确定之后,再利用label-free的原理对其进行定量分析。
实验流程


优势及应用领域
       大规模的蛋白质组N-糖基化位点的鉴定与分析

       应用于疾病机理研究 、信号传导途径分析等
样品要求
        SDS-PAGE条带                 5个以上可见考染条带;

        溶液(目标蛋白质)         目标蛋白质总量>50μg
                                                 目标蛋白质纯度>80%;

        溶液(大规模蛋白质组)     浓度>1μg/μl,
                                                   蛋白总量>1mg





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